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Posted on Mar 6, 2020 3:38:25 AM

在生物磁性分离过程中的放大挑战

在过去的20年间,我们见证了磁珠在生命科学领域应用的爆发式增长,整个行业的销售额维持了双位数增长。这一成功的主要驱动力是应用磁珠作为化学免疫发光测定(CLIA)试剂盒的固相载体。由于其易于自动化,这项技术已成为高通量体外诊断的优选。

CLIA的商业成功促使了IVD试剂盒(和磁珠制造商)加大了生产力度,以应对市场需求。早期的策略是增加批次的数量,通过保持相同的体积和相同的操作程序。然而,这种方法的问题是,需要成比地增加高技能工人人数。除此之外,还需要严格的质量控制来保证每一批次都在可接受的功能和产量范围以内。生产100批100ml磁珠悬浮液以获得总共10L的产品,需要保证每个100ml,相当于每个IVD试剂盒都需要在可接受的误差范围内。这种方法的高成本迫使生产者探索更简单、更经济高效的方法来应对不断增长的需求。

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另一种方法是保持批数恒定,但是增加每批的容量。增加每批的容量使得公司可以控制人工成本和质量成本。如果正确实施,在单个试剂盒上人工和质量控制的成本将会随着批次量成比例地降低 。然而,为了成功地生产制造,您需要在每个样品(通常少于1ml)符合所允许偏差,以达到批次内一致性。成比例放大生物磁性分离过程并不仅仅只是简单地使用一块更大的磁铁。它要复杂得多。在本文和接下来的文章中我们会为您提供最佳技巧,使得这一实验过程变得不那么复杂。

正确地开始成比例放大

开发磁珠是一项复杂的工序。作为诊断试剂,蛋白纯化产品或者新应用,都必须选择正确的生物标记,表面涂层和磁珠。在测试新的性能和实验步骤时,这三方面通常会检查得非常仔细。不幸的是,在很多时候,生物磁性分离过程很少受到重视。在绝大多数情况下,所有的开发都是使用所拥有的小型磁性分离器,或者,有时只是一小块磁铁。

Key1Fig1

如果开发过程顺利,磁性分离器似乎就变成了一个不重要的问题。从问题通常会出现在当实验体积需要从通常的几微升扩大到几十升时。当规模改变,损耗增加,使用“大磁铁”导致不可逆聚集问题时,结果似乎变得前后不一,再悬浮变成了一场噩梦。这些问题也存在于初始规模上,但事实它们往往被归因于缺乏生物标记物或者磁珠的性能上。

实际上,在大多数状况下,问题出自于磁性分离器本身。研发者非常注重指定抗体/蛋白的特性,磁珠尺寸和磁性含量,表面性能,温度和孵化缓冲液的成分。但并不注重生物磁性分离过程本身。在绝大多数情况下,对于分离过程唯一设定的参数是特定设备的分离时间。

正确的开始是了解生物磁性分离过程本身(正如我们在开发过程中使用的其他所有材料和方法一样),然后确定它的参数并对其进行控制。这样的话,我们就能指定分离条件,评估磁力的不同值,并客观地验证磁性分离过程。

如何监测成比放大化过程

成功地成比放大生物磁性分离过程有赖于确定正确的工作条件。在整个工作体积中维持恒定的磁力可以保证批次内一致性,但是制造也需要保证批次间一致性。

批次内的一次性通常决定了在制造过程结束时,检查产品的功能特性,例如CLIA试剂盒中的RLU。

通常是通过目视来控制生物磁性分离步骤。负责该过程的技术人员通常检查在特定分离时间时,悬浮液是否变得澄清透明。这种方法有几个缺点。第一,它只提供了在分离时间时悬浮液的状态信息,但是并没有收集在整个过程中悬浮液透明度的变化。如果分离速度比它应该的速度快(错误浓度,磁珠直径或磁矩的显示器),则在特定的分离时间透明度是相同的,使我们无法区分错误过程和正确过程。

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第二个缺点是测量的主观性。两个不同的人可能有不同的视觉标准,来认定达到“透明”,导致了批次的接受率更高,从而增加了按此制造的产品变异度。

如果是批次的问题,那在制造步骤最后两步之前可能都无法检测出来。不过,也很难判定问题具体出现在那个步骤。

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理想的状况是监测整个生物磁性分离过程。因为在均质状态(分离前)下,悬浮液是深色的,但是当固相被分离时液体会变得透明,我们可以记录在实验过程中的光学变化。结果曲线可以用作每个批次的客观记录。

当应用先进的系统执行生物磁性分离过程时,磁力是恒定的,并且由永磁形成磁场模式。应用这些条件,磁性行为变化会直接反映到悬浮液的变化上,并且生成的S形的分离曲线可以用于质量控制。如果磁珠在分离步骤中不可逆聚集了,在接下来的分离步骤中会表现得比预期分离得更快。

在此例中,对两次连续清洗工艺的光学监测显示,第二条(较浅的曲线)磁性表现得有所不同。裸眼观察可能会给予“通过”状态,因为两个实验过程在分离时间(此例为115秒)都达到了完全透明状态。相比之下,S形曲线将差异量化为t50%(当透明度达到50%时的时间),两次过程分别从37秒到22秒。巨大的差异提示应当提出早期质量警报,但是这也提供了一些关于出现该问题的线索:直径越大磁珠运动速度越快(浓度增大也会导致运动增快,但同时也会改变形状)。因为此例中磁珠相同,在两次清洗步骤之间并没有加入新磁珠,“表面”直径增大可能是由于磁珠不可逆聚集表现得像“大磁珠”。

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对于每个流程步骤,均可形成标准曲线(由预期的“S”形界定)。每个生物磁性分离过程透明化曲线可以与其标准化曲线进行比较。因此,技术人员拥有了强大的工具来检测分离过程中是否有问题:磁珠直径/磁荷错误,磁珠浓度错误,缓冲液黏度有问题。

透明化曲线也为生产团队和质量控制经理提供了一个审查工具,以客观地讨论和回顾实验过程,节约时间,资金和讨论。偏离生物磁性分离标准曲线而产生的警报使得早期矫正措施能够实施,或者在必要时丢弃该批次。对于大批量生产,这意味着在质量终检检查出该问题之前,就已经对不必要浪费的资源(抗体、缓冲液、磁珠)有大量成本节约,同时利用节省下来的时间按时完成生产或以最小的延迟完成生产。另外,因为所有的好处都是无成本获得的,因此在所有先进的生物磁性分离设备中都包含监测选项。

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